表沒食子兒茶素沒食子酸酯，表没是食儿酸酯兒茶素中含量最高活性最強的成分，也是茶素綠茶利好人體健康的主要承擔者。兒茶素的没食結構特征是B-環上有二個或三個羥基基團和A-環上的5，7-二羥基基團，稳定因此具有抗氧化活性。性研EGCG除上述兩個環上的表没羥基外，還在D-環上帶有三個羥基，食儿酸酯在四種主要的茶素兒茶素中，其抗氧化活性最強。没食EGCG不僅可以直接清除胞內活性氧/氮離子，稳定還能螯合幾種具有強正電荷的性研金屬離子；其可使鐵離子失活，抑製超氧化物驅動的表没芬頓反應；抑製H2O2形成和脂質過氧化。因此，食儿酸酯大多研究認為EGCG對人體健康的茶素利好效應源於其卓越的抗氧化能力。
然而，由於EGCG特殊的化學結構特征，穩定性較差，可發生自動氧化和異構反應，根據所處條件(EGCG濃度、pH、溫度和含氧景等)其反應取向不同。當EGCG自動氧化形成多聚物時，可能產生如H2O2一類的活性氧，表現出促氧化活性。有研究發現，50μmol/LEGCG在無細胞的McCoy’S5A培養基中120min，培養基中的H2O2達到峰值25μmol/L。用相同的條件處理HT-29細胞30min後培養體係中的H2O2水平達到最高水平10μmol/L，在活體中，也觀察到了EGCG的促氧化效應，用高劑量的EGCG喂食小鼠，出現劑量依賴的肝髒毒性。但EGCG的促氧化效應在不同的細胞和動物模型中並沒有得到一致的結論。Sheng等發現200μmolZL的H202能顯著誘導正常人心髒成肌細胞H9c2凋亡，而EGCG可抑製H2O2介導的H9c2凋亡，用EGCG單獨處理H9c2時並未觀察到胞內外的H2O2水平的變化。
因此，本文解析EGCG氧化聚合的環境條件，及其穩定性變化對受試細胞氧化還原平衡的影響，為進一步探討EGCG在細胞培養體係及活體中的作用機製奠定基礎。
人正常結腸上皮NCM460細胞購白中科院昆明動物所細胞庫；EGCG粉末購白sigma公司；過氧化氫檢測試劑盒(S0038)購白上海碧雲天公司。
MCO-5AC培養箱SANYO；318C酶標儀上海三科儀器；NanoPhotometerN60分光光度計IMPLEN；VANOX-S顯微鏡0TⅣPUS。
0.15gEGCG粉末融人10mL的三蒸水中攪拌均勻配製成32mmol/L的EGCG溶液，在超淨T作台利用0.2μm針頭濾器進行無菌過濾。待實驗丌始前將EGCG溶液儲存液稀釋至如表1所需濃度。
RPMll640或DMEM培養液Gibco，含10％胎牛血清Gibco；0.1％雙抗(10萬單{ 立/mL)Gibco；1％L-穀氨酰胺(200mmol/L)Gibco。
細胞磷酸緩衝液(PBS)Gibco；0.4％台盼藍Solarbio，0.25％胰蛋白酶Gibco。
實驗選擇了H2O、RPMll640、DMEM(pH=7)三種溶液體係，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置於37℃培養箱恒溫反應24h後，吸取三個重複的150μL溶液置於96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溶液體係對EGCG氧化聚合的影響。
實驗以RPMll640(pH=7)為溶液體係，分別加入不同濃度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L)，置於37℃培養箱和74℃的水浴鍋中恒溫反應24h後，吸取三個重複的150μL溶液置於96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定溫度對EGCG氧化聚合的影響。
實驗以RPMI1640(pH=7)為溶液體係，加入320μmol/L的EGCG，置於37℃培養箱恒溫反應3、6、12、24h後，各組吸取三個重複的150μL溶液置於96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定時問對EGCG氧化聚合的影響。
實驗選用RPMI1640和H20為兩種溶液體係，分別設置不同的pH(pH=5和9)，加入不同濃度的EGCG(0、20、80、320μmol/L)，分別置於37℃培養箱中恒溫處理24h後，各組吸取三個重複的150μL溶液置於96孔板中，檢測578nm的OD值，以確定pH對EGCG氧化聚合的影響。
響接種6個含NCM460的6孔培養板，待細胞貼壁生長後，更換含有不同濃度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMll640培養液，每個6孔板培養時間分別為l、2、3、6、12、24h，在對應的時間節點先取各孔上層培養液50μL，用於胞外H202濃度檢測。之後，弁去含EGCG培養基，胰酶消化後用1mLRPMI1640培養基吹打混勻形成細胞懸液，計數，吸取5×105個細胞，用於胞內H202濃度檢測。
按照過氧化氫檢測試劑盒操作步驟，檢測小同濃度EGCG處理各時間點的培養上清及細胞內H202濃度。
實驗均重複三次，對數據進行整理歸納，利用SPSS17.0統計軟件進行單凶素方差分析，采用GrahPadPrism5製圖軟件作圖分析。
聲明：本文所用圖片、文字來源《食品工業科技》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：L-穀氨酰胺，胰蛋白酶，兒茶素，表沒食子兒茶素沒食子酸酯
