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分別為12.13g/L和620.08mg/L

时间:2025-05-06 13:20:40来源:

1.2懸浮培養

在愈傷組織培養基礎上開展懸浮細胞培養技術研究,天山是實現細胞規模化生產、進而實現細胞培養產業化的雪莲细胞必經之路。以提高生物量、培养提高活性物質含量為目的技术究进,研究人員對天山雪蓮細胞懸浮培養技術進行了係統的化学和药研究,比較了反應器類型、成分培養體係、理作生物合成前體、用研誘導子類型以及光譜特性等因素對細胞懸浮培養結果的天山影響。

1.2.1反應器類型

應用間歇浸沒式小反應器培養天山雪蓮細胞,雪莲细胞發現在培養初期0~6d細胞生長緩慢,培养到15d時生物量和黃酮的技术究进產量達到最大值,分別為12.13g/L和620.08mg/L,化学和药生物量隻有搖瓶培養的成分2/3;應用氣升式反應器培養天山雪蓮細胞,發現培養初期0~3d細胞生長緩慢,理作3d後細胞開始快速生長,到第15天時達到最大值11.7g/L,培養過程中黃酮含量除在第3天有一個輕微的上升外,一直呈下降趨勢。2種反應器培養雪蓮細胞過程中pH和電導率與搖瓶培養相比變化緩慢。

1.2.2培養體係

通過比較不同的基礎培養基對雪蓮細胞培養的影響,發現MS培養基最有利於細胞的生長,懷特培養基中的細胞黃酮含量最高,而在B5培養基中獲得最高黃酮產量。通過考察不同培養基、培養基初始pH、碳源、接種量、植物生長物質含量對雪蓮細胞生長和黃酮合成的影響,結果發現,N6液體培養基在pH5.8、蔗糖50g/L、接種量60~80g/L時有利於細胞生長和黃酮合成,附加BA0.2mg/L+NAA2mg/L有利於黃酮合成,而附加BA0.5mg/L+NAA3mg/L則對生長有利。應用培養基MS+NAA5.0mg/L+蔗糖3%,在pH5.8、振蕩器轉速(120±5)r/min、培養溫度(24±1)℃、光照周期12h/d以及光照強度85μmol·m-2/s培養條件下,采用最佳接種質量濃度2.53g/L,在懸浮培養14d時細胞的幹重和鮮重均達到最大,分別為16.85、235.28g/L。

1.2.3有機添加物

添加苯丙氨酸和水解酪蛋白能夠顯著地提高黃酮的合成量,分別比未添加對照提高了47.68%和21.59%;添加椰乳顯著地提高細胞生長,生物量比對照提高了36.1%。

1.2.4外源添加碳源和生物合成前體

在每升培養基添加蔗糖50g和生物合成前體L-苯丙氨酸500mg的優選培養條件下,僅需培養16d,紫丁香苷、綠原酸和1,5-二咖啡酰奎尼酸的質量濃度即可以分別達到339.0、225.3、512.7mg/L;三者的含量分別為野生藥材的67.9、1.9、10.6倍。

1.2.5添加誘導子

1.2.5.1非生物誘導子

在培養的第14天添加濃度為50μmol/L的一氧化氮,總黃酮量和產量的最大值分別為46.15mg/g和830.7mg/L;在第14天添加濃度為50μmol/L的水楊酸,總黃酮量和產量的最大值分別為46.81mg/g和701.79mg/L;在第6天添加濃度為100μmol/L的茉莉酸甲酯,總黃酮量和產量的最大值分別為52.33mg/g和924.67mg/L。3種非生物誘導子均能促進總黃酮含量和苯丙氨酸代謝途徑關鍵酶PAL活性的增加,除水楊酸外,也能促進細胞生物量的增加。25mg/L的殼聚糖誘導子對生物量沒有明顯的促進作用,但能顯著地促進黃酮的合成,最大的黃酮產量高達1243.5mg/L,比對照提高了33%。

1.2.5.2生物誘導子

5種真菌誘導子F1817、F1832、F1780、F1953、F2563均能促進次生代謝產物總黃酮和紫丁香苷的積累,誘導效果最好的為誘導子F1953,總黃酮和紫丁香苷含量均達到最大值,質量分數分別為46.56mg/g和3.03mg/g。

1.2.5.32類誘導子聯合使用

通過非生物誘導子(一氧化氮、水楊酸和茉莉酸甲酯)和生物誘導子(F1817、F1832、F1780、F1953和F2563)的聯合誘導提高了天山雪蓮細胞有效成分的含量,細胞中總黃酮量最大值為60.41mg/g,是野生藥材的3.00倍;培養物中紫丁香苷量達到3.10mg/g,是野生藥材的11.48倍。

1.2.6光譜特性

紅光最有利於細胞的生長,在紅光下獲得最大生物量;藍光最有利於黃酮的合成,在藍光下獲得最大黃酮含量和產量。藍光加白光的組合有利於黃酮的合成。

1.3毛狀根培養

天山雪蓮這一品種的細胞培養技術研究主要集中於愈傷組織培養和懸浮細胞培養,毛狀根培養的報道較少。付春祥等利用發根農杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪蓮的葉片、葉柄和根段外植體,誘導產生毛狀根。毛狀根接種量為2.8g/L時,20d生長量可達66.7g/L,黃酮含量達到幹重的10.23%。冠癭堿的檢測和rolB基因的PCR分析表明,Ri質粒中的T-DNA片段已經整合到毛狀根細胞的基因組中。預培養2d的新疆雪蓮根段外植體,經過R1601感染後,毛狀根的誘導率可達100%,說明預培養時間、外植體類型以及發根農杆菌的菌株屬性對毛狀根誘導有著重要的影響。喬獻麗等研究了外源激素GA3和IAA對3個轉基因新疆雪蓮類黃酮高產毛狀根係C17、C27、C46總黃酮含量的影響,結果表明,與未用激素處理的毛狀根相比,外源激素GA3和IAA能顯著提高毛狀根培養物中芹菜素和總黃酮的含量。毛狀根係的組織幹重與類黃酮的含量沒有相關性。

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